Current Date:22.07.2024

Лечение рака: Паклитаксел и другие таксаны в фундуке (Анджела Хоффман,Ферейдун Шахиди)

Небольшие количества паклитаксела (Таксол ® ) были выделены из твердой скорлупы, зеленых оболочек и листьев фундука Томбул ( Corylus arellana L.). Помимо паклитаксела в экстрактах обнаружены 10-деацетилбаккатин III, баккатин III и цефаломаннин. Таксаны не были обнаружены в ядрах и скорлупе орехов этого сорта. Присутствующие количества варьировались от 8,61 до 68,22 микрограммов на грамм образца в обезжиренном и высушенном виде. Хотя возможно, что эти таксаны производятся грибами, связанными с фундуком, вполне вероятно, что они производятся тканями растения.

1 . Введение

Многие растения рода Taxus (тис) производят комплекс дитерпеноидов паклитаксел, противораковый ингредиент Таксола ® , который продается компанией Bristol Myers Squibb и одобрен Управлением по контролю за продуктами и лекарствами США для лечения заболеваний яичников, молочной железы и рак легких, а также саркома Капоши, связанная со СПИДом ( Waniet al., 1971 , Baloglu and Kingston, 1999a ). Эта молекула повышает стабильность микротрубочек в клетке и индуцирует апоптоз ( Horwitz et al., 1993 , Wang et al., 1999 ). Паклитаксел принадлежит к более широкому классу дитерпеноидов, известных как «таксаны» ( рис. 1 ). Эти соединения известны как «вторичные метаболиты», поскольку они не необходимы для роста растения, но помогают в его защите от окружающей среды и других внешних факторов. Возможная роль паклитаксела у тиса может заключаться в защите от патогенов ( Stierle et al., 1995 ).

У тиса выход паклитаксела обычно составляет от 0,004% до 0,1% в пересчете на сухую массу ( Witherup et al., 1990 , Wheeler et al., 1992 , Kelsey and Vance, 1992 ;). Из-за растущего числа альтернативных применений паклитаксела, включая его перспективность для лечения псориаза, поликистозной болезни почек, рассеянного склероза и болезни Альцгеймера, среди прочего, ведется поиск дополнительных источников этого соединения (Ketchum et al., 1995, Strobel ) . , 1996 ). Также был осуществлен полный синтез паклитаксела ( Nicolaou et al., 1994 , Holton et al., 1994 ), но это не является экономически эффективным методом получения паклитаксела. Современные методы производства паклитаксела включают экстракцию непосредственно из тиса и полусинтез из других таксанов, экстрагированных из тиса ( Baloglu & Kingston, 1999b ).Стирле и др. (1993) сообщили об открытии паклитаксела в культуральной среде Taxomyces andreanae , нового гриба, выделенного из ветвей Taxus brevifolia . Недавно таксаны были выделены из ряда других грибов ( Stierle et al., 1995 , Shrestha et al., 2001 ). Хоффман и др. (1998) использовали ВЭЖХ-масс-спектрометрию с термораспылением для обнаружения паклитаксела и родственных таксанов в стеблях и ветвях Corylus avellana cv. «Гасуэй». Это было первое обнаружение таксанов в тканях покрытосеменных растений. Возможно, что грибковый эндофит способствовал выработке паклитаксела и других таксанов в тканях Corylus . Однако небольшие количества паклитаксела были также обнаружены в аксенических (свободных от микробов) культурах «Gasaway» ( Hoffman & Bufford, неопубликованные результаты ).В данной статье мы сообщаем об извлечении паклитаксела и некоторых других таксанов из экстрактов коричневой твердой скорлупы, зеленого покрова скорлупы и листьев фундука Томбула ( Corylus arellana L.).

2 . Материалы и методы

2.1 . Продукты из фундука и их добыча

Фундук Томбул ( Corylus arellana L.) был произведен в Гиресуне, Турция, а побочные продукты, а именно коричневая твердая скорлупа, зеленая оболочка скорлупы и листья, были измельчены до размера менее 100  мкм, а затем обезжирены гексаном. Неочищенные экстракты фенольных соединений готовили экстракцией 80% водным этанолом (1:10, мас./об.) при 4  °С в течение 16  часов. Полученные суспензии центрифугировали при 4000 g в течение 5  мин и собирали надосадочную жидкость. Остатки повторно экстрагировали аналогичным образом и экстракты объединяли. Затем растворитель удаляли в ротационном испарителе при 40  °С и концентрированные суспензии лиофилизовали при -47  °С в течение 72  часов.

2.2 . Хранение и обработка образцов

Экстракты проб растворяли в метаноле и небольшом количестве воды (5–10%). Метанол выпаривали и водную смесь выливали на колонку с пипеткой С-18 для удаления избытка солей натрия. Образец промывали из колонки С-18 метанолом. Растворитель выпаривали и образец повторно растворяли в метаноле до концентрации 200  г/л. Между анализами образцы хранили при -20  °С в морозильной камере в высушенном виде.

2.3 . Условия хроматографии ЖХ-МС

Разделение проводили с использованием колонки для ВЭЖХ Restek Allure C18, 5  мкм, 100  ×  3,2  мм (Bellefonte, PA). Градиентные условия: 100% подвижной фазы A (удерживается в течение 1  минуты) и увеличивается до 100% подвижной фазы B в течение 20-  минутного периода и выдерживается в течение 5  минут. Подвижная фаза А: (вода:1  мМ ацетат аммония:0,1% уксусная кислота:1% метанол (1:1:1:1, об/об/об/об)); подвижная фаза B (99% метанол в воде:1  мМ ацетат аммония:0,1% уксусная кислота (1:1:1, по объему/объему)). Скорость потока растворителя: 4,5  мкл/мин, объем впрыска — 0,5  мкл.

2.4 . Масс-спектрометрия с электрораспылением/ионной ловушкой

Для обнаружения таксанов в реальном времени при массовом соотношении 50–2000 использовали прибор ThermoQuest Finnegan LCQ TM (Сан-Хосе, Калифорния), оснащенный источником ионов электрораспылением (ES), и он работал в режиме положительных ионов. Игла ES работала при напряжении примерно 4,5–5,2  кВ. Напряжение распыления составляло 4,82  кВ и использовался ток 2,10 мкА.

2.5 . Идентификация таксанов

Молекулярные и другие ионы в экстрактах сравнивались с аутентичными стандартами (Hauser, Boulder, CO) и с таблицами, представленными в исследовании Kerns et al. (1994) .

2.6 . Жидкостная хроматография

Разделение для количественного определения таксанов проводили с использованием бинарной системы доставки растворителя Dynamax и детектора поглощения УФ-1 (Rainin/Varian, Emeryville, CA) при длине волны 228  нм с колонкой Curosil B с обращенной фазой (Phenomenex, Torrance, CA) и скорости потока 1,0  мл/мин с 45% ацетонитриловым и 55% аммонийно-ацетатным буфером (1  мМ, pH 4) в изократических условиях. Контролировали шесть таксанов: 10-деацетилбаккатин III (4,8–4,9  мин), баккатин III (6,7–6,8  мин), 10-деацетилтаксол (11,4–11,6  мин), цефаломаннин (14,7–15,0  мин), 7-эпи-10. -деацетилтаксол (16,5–16,7  мин) и паклитаксел (17,5–17,8  мин). Десять микролитров каждого образца вводили как минимум дважды без стандартов, чтобы убедиться, что данные репрезентативны для образца, а затем один раз вводили стандарты.

Колонку калибровали по нескольким концентрациям каждого из шести аутентичных стандартов таксанов, и площади пиков могли использоваться для оценки количества таксанов в экстрактах. Расчеты проводились в электронной таблице Excel.

3 . Результаты и обсуждение

Экстракты муки из зрелых орехов, коричневой твердой скорлупы, зеленой оболочки скорлупы и листьев анализировали с помощью ВЭЖХ на калиброванной колонке с обращенной фазой, используя условия, описанные в разделе 2 . Соответствие времени удерживания было обнаружено для нескольких таксанов в экстрактах листьев, зеленой оболочки скорлупы и коричневой твердой скорлупы. Две репрезентативные хроматограммы ВЭЖХ на рис. 2 показывают относительное время удерживания таксанов.

Рис. 2 . ВЭЖХ-хроматограммы извлеченных образцов Corylus . (A) Экстракт зеленой оболочки скорлупы с шестью стандартами таксанов и (B) экстракт листьев без добавления стандартов.

Данные ВЭЖХ проверяли с помощью LC/MS. На рис. 3 показаны репрезентативные масс-спектры паклитаксела и цефаломаннина из экстракта листьев. Они подтверждают, что эти таксаны присутствовали в экстракте и что паклитаксел присутствовал в более высокой концентрации, чем цефаломаннин. Звездочки на спектрах указывают массы, которые были наиболее полезны для идентификации соединений ( Kerns et al., 1994 ).

Рис. 3 . Масс-спектры таксанов, обнаруженных в экстракте листьев: (А) паклитаксел и (Б) цефаломаннин. Звездочками отмечены пики ионов, необходимые для идентификации таксанов.

В таблице 1 приведены количества таксанов, определенные количественно по пикам ВЭЖХ, которые были подтверждены данными ЖХ/МС. Концентрации этих таксанов, по-видимому, низкие и могут составлять примерно десятую часть от таковых в тисе тихоокеанском. Экстракты коричневой скорлупы и листьев содержали 10-деацетилбаккатин III, цефаломаннин и паклитаксел, но экстракт зеленой скорлупы содержал только баккатин III. Хотя ничего не обнаружено, вполне возможно, что таксаны могут присутствовать в ядре фундука. Паклитаксел и многие другие таксаны лучше растворяются в масле фундука, чем в растворителях, используемых для их экстракции. Таксаны могли быть удалены вместе с нефтью при первоначальной экстракции.

Таблица 1 . Содержание таксанов (микрограммы на грамм обезжиренной и высушенной исходной пробы) листьев, коричневой твердой скорлупы и зеленой покровной скорлупы фундука

Образец10 дней БIIIБIII10дТЦеф7,10дТПаклитаксел
Лист7,71–1,48без датыбез даты0,16–0,01без даты0,74–0,08
Коричневая оболочка22.52–3.53без датыбез даты43,80–8,36без даты1,90–0,13
Зеленая ракушкабез даты67,77–1,10без датыбез датыбез датыбез даты

Выходы экстрактов из обезжиренных образцов составили 1,64–0,11% по экстракту листьев. 2,53–0,28 % для экстракта коричневой скорлупы и 3,59–0,70 % для экстракта зеленой скорлупы.

Сокращения следующие : 10d BIII, 10-деацетилбаккатин III; BIII, баккатин III; 10дТ, 10-деацетилтаксол; Цеф, цефаломаннин; 7,10дТ, 7-эпи-10-деацетил таксол и НД не обнаружены. Концентрация образца составляла 200  г/л,  вводили 10 мл.

Таксаны, обнаруженные в исследованных экстрактах тканей фундука, по существу находятся в том же соотношении, что и в некоторых видах тиса ( Kelsey and Vance, 1992 , Witherup et al., 1990 ). Это позволяет предположить, что механизм накопления таксанов у этих двух организмов может быть сходным. Однако общее содержание таксанов в обезжиренных продуктах из побочных продуктов из фундука, по-видимому, составляет лишь небольшую часть от такового в тисе тихоокеанском, который обычно составляет 0,004–0,1% в пересчете на сухой вес. Тем не менее, деревья фундука растут намного быстрее, чем тис тихоокеанский. Таким образом, побочные продукты переработки фундука могут служить легкодоступным возобновляемым источником таксанов и альтернативой натуральной коре тиса.

Share